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Pierce™ 交聯磁性 IP/Co-IP 試劑盒

Thermo Scientific Pierce 交聯磁性 IP/Co-IP 試劑盒使用交聯化學方法將 IP 抗體共價固定在優(yōu)質蛋白 A/G 磁珠上，以實現有效的免疫沉淀和免疫共沉淀。

因為該磁性 IP 程序涉及用于免疫沉淀的特異性抗體的共價結合，所以可在不使用抗體片段的情況下洗脫和分析靶蛋白或 co-IP 蛋白復合物，原因是該抗體仍黏附在微珠上。該試劑盒包含優(yōu)化的方案以及使用與蛋白 A/G 結合的抗體和手動或自動磁性分離工具用于獲得高得率 IP 或 co-IP 所必需的所有緩沖液和試劑。

交聯磁性 IP/Co-IP 試劑盒的特點：

•無抗體 IP—抗體與磁珠不可逆地連接，使得完整抗體或含有純化抗原的重鏈和輕鏈的共洗脫可忽略不計
•便利—IP/co-IP 試劑盒包含磁珠以及所有用于理想免疫沉淀所必需的緩沖液
•快速—可在 3 小時內完成交聯和免疫沉淀
•高效—與其他磁珠相比，使用一半推薦體積的磁粒子進行免疫沉淀
•兼容—與蛋白 A/G 重組蛋白偶聯的磁珠可確保與大多數一抗（無論來自小鼠還是兔）兼容
•可擴展—僅需使用少量抗體即可進行單次 IP 實驗或制備更大數量的抗體交聯磁珠進行多次實驗

Pierce 交聯磁性 IP/Co-IP 試劑盒的方案為使 IP 抗體與蛋白 A/G 磁性微珠結合，然后使用辛二酸二琥珀酰亞胺酯 (DSS) 將抗體共價交聯至微珠。然后將抗體交聯微珠與含有目標蛋白抗原的細胞裂解物或組織提取物一起孵育，使得抗原:抗體復合物可以形成。洗滌微珠以去除未結合的材料，并使用低 pH 值洗脫緩沖液從抗體-交聯微珠分離結合的抗原。包括中和緩沖液，以防止分離抗原沉淀，并確保下游應用中的蛋白活性。包含用于制備 SDS-PAGE 分析樣品的泳道標志物樣品緩沖液。該方案針對 2 至 10 µg IP 抗體進行了優(yōu)化。為獲得較佳 co-IP 得率，使用 5 至 10 µg 抗體。使用磁力架手動從溶液中取出磁珠或者使用 Thermo Scientific KingFisher Flex 儀器等儀器通過自動化操作從溶液中取出磁珠。

傳統(tǒng) IP（無共價抗體連接）的抗原得率通常高于使用交聯的 IP 方案。這是因為交聯過程不可避免地會引起一些功能性抗體結合位點的損失。為了克服交聯方法的這一限制，在交聯 IP 方法中需要使用的 IP 抗體量可能多于等效傳統(tǒng) IP 程序。當然，交聯免疫沉淀程序的優(yōu)勢在于 Western 印跡無干擾抗體條帶。

方案總結
1：用 1X 偶聯緩沖液預洗微珠。
2：使抗體與蛋白 A/G 磁珠結合 15 分鐘。
3：用 1X 偶聯緩沖液洗滌微珠三次。
4：使用 DSS 將抗體交聯至微珠，持續(xù) 30 分鐘。
5：用洗脫緩沖液洗滌微珠三次，然后用 IP 裂解/洗滌緩沖液洗滌兩次。
6：將細胞裂解物與制備的微珠在室溫下孵育 1-2 小時或在 4°C 下過夜孵育。
7：用 IP 裂解/洗滌緩沖液洗滌微珠兩次，然后用純化水洗滌一次。
8：洗脫結合抗原。

Pierce™ 交聯磁性 IP/Co-IP 試劑盒